溶血性链球菌!（什么是溶血性链球菌！） 链球菌普遍存在于各种动物体内，大多数是宿主特异性的，不同的菌株感染不同种动物。链球菌可导致一系列的疾病，包括脑膜炎、败血症、多发性浆膜炎、关节炎、心内膜炎和肺炎。链球菌在鼻炎和流产的病例中也曾被分离到，说明它还和这两种病症有关。链球菌感染发病模式与严重程度因不同地区而异。链球菌有很多个血清型，其中猪链球菌至少有34个血清型。它们在致病性和临床症状方面各不相同，且同一血清型的致病性和临床症状在不同情况下也会有不同表现。有些血清型主要是从健康猪体内分离得到的，不具致病性；有的主要造成肺部损伤；有的可感染猪，也可感染其他动物。有的血清型，主要是2型，不仅可导致猪脑膜炎，偶尔还会造成人脑膜炎。 1 病原学特征 1.1 形态与染色 链球菌呈球形或卵圆形，直径0.6～1.0μm，呈链状排列，短者由4～8个细菌组成，长者由20～30个细菌组成，链的长短与细菌的种类和生长环境有关。在液体培养基中易呈长链，在固体培养基中常呈短链，由于链球菌能产生脱链酶，所以在正常情况下链球菌的链不能无限制地延长。多数菌株在血清肉汤中培养2～4h易形成透明质酸荚膜，继续培养后荚膜可被细菌自身产生的透明质酸酶分解而消失。该菌不形成芽孢，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏染色（图2-4）阳性，长时间培养或被中性粒细胞吞噬后转为革兰氏染色阴性。 1.2 培养特征 需氧或兼性厌氧菌，对营养的要求较高，在普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、葡萄糖等才能生长。最适生长温度为37℃，在20～42℃下能生长，最适pH为7.4～7.6。在血清肉汤中易呈长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5～0.75mm的细小菌落，不同菌株有不同溶血现象（图2-5）。 1.3 生化反应 分解葡萄糖，产酸不产气，对乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、海藻糖、七叶苷的分解能力因不同菌株而异。一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，触酶试验阴性。 1.4 抗原结构 链球菌的抗原构造较复杂，主要有三种： （1）核蛋白抗原 或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同，与葡萄球菌有交叉。 （2）多糖抗原 或称C抗原，为群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。应用多糖抗原，根据兰氏（Lancefield）血清学分类，可将链球菌分成许多群。目前有A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U19个血清群，每个血清群又有若干个血清型。根据菌体荚膜抗原特性不同，猪链球菌共可分成35个血清型，即1～34型和同时含有1型和2型抗原的1/2型。 （3）蛋白质抗原 或称表面抗原，具有型特异性，位于多糖抗原外层，其中可分为M、T、R、S4种不同性质的抗原成分。与致病性有关的是M抗原，M抗原具有抗吞噬作用，并使链球菌易于黏附在上皮细胞上。根据M抗原不同可将A群链球菌分为60多个血清型。R、T、S抗原与致病性和毒力关系不大，但可用于链球菌的分型。 1.5 分类 根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血性质，将其分为三类。 1.5.1 α-溶血性链球菌 菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血性链球菌，这类链球菌多为条件致病菌。 1.5.2 β-溶血性链球菌 菌落周围形成一个2～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血性链球菌，这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病性强，常引起人类和动物的多种疾病。 1.5.3 γ-链球菌 不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型或不溶血性链球菌，该菌无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔也引起人或动物感染。 1.6 抵抗力 该菌抵抗力一般不强，60℃经30min即被杀死，对常用消毒剂敏感，在干燥尘埃中可生存数月。乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。βＧ内酰胺类药物是链球菌感染的首选药物。 2 流行病学特征 链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播感染或通过皮肤、黏膜伤口感染，被污染的食品如肉、蛋、乳及其制品也会感染人类。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。 3 危害 链球菌种类多，与人类有密切关系的是猪链球菌。在猪链球菌众多血清型中，2型链球菌是猪的最主要病原，致病性最强。链球菌的致病性与溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、溶血素等毒力因子有关。 在我国，2005年四川部分地区发生的2型猪链球菌病暴发流行导致200多人感染、38人死亡。在荷兰，每年屠宰场的工人和养殖场饲养员患猪链球菌脑膜炎的比率大约为3/100000，是不在屠宰场工作的人患猪链球菌脑膜炎的1500倍，屠夫患猪链球菌脑膜炎的比率为1.2/100000。在德国，屠夫、屠宰场工人和肉品加工厂工人是猪链球菌在鼻咽部定居的高危人群。在新西兰，1980年以后的研究显示9%的奶牛场主、10%的肉品检验员及21%的猪场主对猪链球菌2型血清反应为阳性，表明一些人有亚临床感染。 4 检测方法 包括病原的分离鉴定方法及分子生物学方法、免疫学方法ELISA等。 4.1 分离鉴定方法 4.1.1 样品处理 取25g（或25mL）待检样品，加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。 4.1.2 接种培养 吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤中，或直接划线于血平板上（如待检样品污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤中），36℃培养24h，接种于血平板上，36℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行环磷酸腺苷（CAMP）试验、链激酶试验和杆菌肽敏感试验。 4.1.3 CAMP试验 在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直，但不要接触，二者相距3～5mm，各链球菌分离菌划线间距10～20mm。置37℃温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。 4.1.4 链激酶试验 吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18～24h36℃肉浸液肉汤培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL，混匀，36℃水浴10min，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。 4.1.5 杆菌肽敏感试验 取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04U的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18～24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。 4.2 分子生物学方法 挑取单个可疑菌落接种于Luria-Bertani（LB）肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜，取1.0mL菌悬液于1.5mL离心管中，用冷冻离心机12000r/min离心10min，弃去上清液，再加入1.0mL灭菌双蒸水，涡旋制成菌悬液，放入水浴锅中煮沸10min，3000r/min离心5min，以上清液为模板进行扩增。上游引物为：5′ -GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3′，下游引物为：5′-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3′。反应体系：10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）1μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板5μL，用ddH2O补至50μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸45s，共作用35个循环，72℃再延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为197bp的扩增产物为链球菌阳性。 4.3 ELISA 4.3.1 包被 用0.05mol/LpH9.0碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL抗体，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min（以下简称洗涤）。 4.3.2 加样 加一定稀释的菌液0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。 4.3.3 加酶标抗体 于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1mL。37℃孵育0.5～1h，洗涤。 4.3.4 加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。 4.3.5 终止反应 于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。 4.3.6 结果判定 可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以＂＋＂＂－＂号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。