差减杂交通过Tester(T,待富集特有序列的样本)第一链cDNA与Diver(D,用于扣除tester中共有序列的样本)mRNA在一定温度下复性,并用羟基磷灰石柱层析除去cDNAmRNA杂合体,以此富增Tester样本中特异的cDNA。较传统的差示筛选方法灵敏度有所提高,但mRNA需要大量的Driver才能使杂交充分进行。此外经过层析,所回收的cDNA量很低,严重影响实验的进一步进行。
分类
代表性差异分析(representationaldifferenecanalysis,RDA)
酶降解差减杂交(enzymaticdegradingsubtraction,EDS)
接头捕获差减杂交(linkercapturesubtractionLCS)
抑制性差减杂交(suppressionsubtractivehybridizationSSH)
步骤
第一步:对T群和D群的cDNA(原核生物为DNA,下同)进行PCR扩增。
第二步:给T群的cDNA加“修饰”,使之区别于D群的cDNA,可以通过加接头(RDA、LCS及SSH)或掺入放射性核素来实现。
第三步:用过量的DcDNA,与经“修饰”过的TcDNA混合,经变性后退火复性,T与D中共有的序列形成TD异源杂交分子,T中特有的序列形成TT同源杂交分子
第四步:通过PCR扩增或酶解反应,只有TT分子能得到有效扩增或保留。
这种差减杂交步骤可重复数次以尽可能去除共有的序列,同时使T群中特有的序列得到富集。
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