质粒构建问题频出？一篇文章帮你扫清所有障碍

　　研究一个蛋白质的第一步是拿到它准确的基因序列，有了基因序列，我们就可以构建合适的质粒，表达出所需要的蛋白。
　　质粒构建，英文名为plasmidconstruction。选定的目的外源基因（DNA）先要经过PCR扩增。随后用限制性内切酶分别切割载体和外源DNA片段，再使用DNA连接酶将切割后的载体与DNA片段连接，转入宿主细胞。最后经过筛选鉴定出正确的重组克隆质粒，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
　　图一：质粒构建流程示意图
　　1、如何选择载体？
　　载体通常分为克隆载体（CloningVector）与表达载体（ExpressionVectors）两种。
　　克隆载体大多是高拷贝载体，能够将外源基因与克隆载体的质粒连接，导入原核细菌内，进行大量复制克隆。主要用途是保存目的基因片段。
　　在选择克隆载体时应注意：
　　具有自主复制能力，拷贝数高；
　　携带易于筛选的选择标记；
　　含有多种限制酶的单一识别序列，以供外源基因插入；
　　载体应尽可能小（15kb），便于导入细胞和进行繁殖；
　　使用安全。克隆载体应只存在于有限范围的宿主内，在宿主体内不进行重组，不发生转移，不产生有害性状，并且不能离开工程宿主自由扩散。
　　表达载体是为了使插入的外源DNA序列转录、翻译成多肽链而进行特殊设计的克隆载体。它含有特定的表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。
　　根据表达的类型，表达载体可分四类：
　　非融合型表达载体，如PKK2233；
　　分泌型表达载体，如PINompA1；
　　融合蛋白型表达载体，如PGEX；
　　包涵体型表达载体，如pBV220。
　　图二：基因片段选择
　　2、引物设计中的规则
　　运用PCR扩增目的基因的过程中，引物设计十分关键，以下是需要注意的：
　　引物长度最好在1830bp左右，常用的长度是2022bp；
　　引物Tm值最好在60左右，两条引物间Tm值要保持接近，相差最好不要超过5C；
　　GC的含量标准通常为4060或4555；
　　引物自身不应含有连续超过4个的互补的碱基，避免形成发卡结构或形成引物二聚体；
　　引物的3端要避免出现连续重复的碱基，如GGG或CCC，这会导致错配的发生，最后一个碱基最好是G或C；
　　在引物的5端添加酶切位点时（在不影响扩增的特异性的前提下），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，通常多加3个碱基即可满足保护酶切位点的需求；
　　上下游引物最好加入不同的酶切位点，相同的酶切位点可能导致目的基因片段出现倒置连接现象，影响基因序列的正常表达。
　　3、PCR扩增中常见的问题
　　扩增基因的过程并不困难，但未必能保证百分之百的成功率。
　　如结果出现引物二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象，可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，来提高扩增特异性。
　　若出现凝胶条带弥散状态，多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因。
　　长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键。
　　4、其他问题
　　在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足，例如：双酶切尽可能选择同种缓冲buffer，一般用量40U单位以上（用量不超过总体积110），保证酶切过程充分；可根据目标片段量（ng）（载体量（ng）目标片段长度（kb））（载体DNA片段长度（kb））目标片段和载体的摩尔比（1：31：8）计算出目标片段和载体的加入量，提高连接效率。
　　构建好的载体放入感受态细胞中转化（TOP10、DH5、BL21等，感受态细胞在使用时尽可能保证新鲜，避免反复冻融，冰上孵育和热激时间应严格控制），经抗性、菌落PCR、酶切、测序等多道程序验证，确定是否转化成功，最终获得正确的重组克隆基因片段。
　　5、如何选择正确的菌株和载体（详见文末列表）
　　公司简介
　　青云瑞晶是一家专业的CRO（研发服务提供商）。公司拥有高标准的实验室、先进的设备，和丰富经验的博士硕士研究人员，在结构生物学，药物固态研究和新材料结构表征，三个业务板块，为客户提供最先进的解决方案。
　　公司自主开发了国际领先的MicroED结构解析平台，结合冷冻电镜单颗粒（CryoEMSPA）及同步辐射单晶X射线衍射（XRD），为客户解决难点问题。
　　Ecolistrainlist
　　No。
　　strain
　　annotation
　　Resistant
　　1hrBL21（DE3）
　　最常用的
　　No
　　2hrRosetta（DE3）
　　稀有密码子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA
　　Cl
　　3hrRosetta2（DE3）
　　稀有密码子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA和CGG
　　Cl
　　3hrOrigami2（DE3）
　　二硫键及稀有密码子
　　StrR，Tet
　　4hrC41（DE3）orC43（DE3）
　　疏水性蛋白
　　No
　　5hrArctic（DE3）
　　TPN30TPN60分子伴侣
　　Tet，Cam
　　6hrTuner（DE3）
　　通过IPTG精确控制表达量，0。1mMIPTG
　　No
　　7hrBL21（DE3）pLysS
　　降低毒性蛋白的本底表达
　　Cl
　　8hrRosetta（DE3）pLysS
　　降低毒性蛋白的本底表达，稀有密码子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，和GGA。
　　Cl
　　9hrBL21（DE3）delslyXD
　　BL21（DE3）knockoutslyXD
　　No
　　10hrB834（DE3）
　　Met缺陷菌株
　　No
　　11hrT7pLysY
　　具有抗T1噬菌体感染能力
　　Cl
　　12hrBL21star（DE3）
　　13hrorigamiB（DE3）
　　二硫键
　　KanR，TetR
　　14hrOrigami2（DE3）pLysS
　　Origami2（DE3）的基础上加pLysS抑制本地表达。
　　Cl，StrR，Tet
　　15hrDh5
　　克隆菌株
　　No
　　16hrDh5T1
　　具有抗T1噬菌体感染能力
　　No
　　17hrDh10bac
　　Bacmid制备
　　Tet，gentamicin
　　18hrBL21Gold（DE3）
　　可以同时用作蛋白表达菌株和质粒克隆菌株
　　No
　　Plasmidlist
　　名称
　　长度
　　抗性
　　特殊性能
　　PAO815
　　7709bp
　　Amp
　　酵母表达
　　pAxCAwt
　　44741bp
　　Amp
　　腺病毒表达
　　pAxcw
　　42410bp
　　Amp
　　腺病毒表达
　　pAAVMCS
　　4。7kbp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pBacPAK8
　　5。5kbp
　　Amp
　　杆状病毒表达
　　PBI121
　　13。0kbp
　　Kan
　　植物细胞表达
　　pBV220
　　3665bp
　　Amp
　　原核表达
　　pCAMBIA1300
　　植物细胞表达
　　pCAMBIA1301
　　11837bp
　　Kan
　　植物细胞表达
　　pCAT3Basic
　　4047bp
　　Amp
　　pcDNA3
　　5446bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pcDNA3。1（）
　　5428bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pcDNA3。1mysHisA
　　5494bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pClneo
　　5472bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pCMVMCS
　　4。5kbp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pET3a
　　4640bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET11a
　　5677bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET15b（）
　　5708bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET20b（）
　　3716bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET22b（）
　　5493bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET23a（）
　　3666bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET23b（）
　　3665bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET23c（）
　　3664bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET23d（）
　　3663bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET28a（）
　　5369bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET28b（）
　　5368bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET28c（）
　　5367bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET30a（）
　　5422bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET30b（）
　　5421bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET30c（）
　　5423bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET31b（）
　　5742bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET32a（）
　　5900bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET32b（）
　　5899bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET32c（）
　　5901bp
　　Amp
　　大肠杆菌表达
　　pET39b
　　6106bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pET42a
　　5930bp
　　Kan
　　大肠杆菌表达
　　pGAPZaA
　　3147bp
　　Zeo
　　酵母表达
　　pGBKT7
　　7。3kbp
　　Kan
　　酵母表达
　　pGEM3Zb
　　原核表达
　　pGEM3Zf（）
　　原核表达
　　pGEM7Zf（）
　　原核表达
　　pGEX2T
　　4969bp
　　Amp
　　原核表达
　　pGEX4T1
　　4969bp
　　Amp
　　原核表达
　　pGFPN2
　　4732bp
　　Kan
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pEGFPC1
　　4731bp
　　Kan
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pEGFPC3
　　4727bp
　　Kan
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pEGFPN1
　　4733bp
　　Kan
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pLEGFPN1
　　6892bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pGL3Basic
　　4818bp
　　Amp
　　pGL36
　　pLNCX
　　6620bp
　　Amp
　　反转录病毒表达
　　pLNHX
　　5。6kbp
　　Amp
　　反转录病毒表达
　　pLXSN
　　5。9kbp
　　Amp
　　反转录病毒表达
　　pLXIN
　　6。1kbp
　　Amp
　　反转录病毒表达
　　pMALp2x
　　6721bp
　　Amp
　　原核融合蛋白表达
　　pMALc2x
　　6721bp
　　Amp
　　原核融合蛋白表达
　　pPIC3。5K
　　9004bp
　　AmpKan
　　酵母表达
　　pPIC9
　　8024bp
　　Amp
　　酵母表达
　　pPIC9K
　　9276bp
　　Amp
　　酵母表达
　　pPICZaA
　　3593bp
　　Zeo
　　酵母表达
　　pQBIPGK
　　5387bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞荧光蛋白表达
　　pQE30
　　3461bp
　　Amp
　　原核表达
　　pQE9
　　3439bp
　　Amp
　　原核表达
　　pRevTRE
　　6487bp
　　Amp
　　反转录病毒表达
　　pSE420L
　　4617bp
　　Amp
　　pTacI
　　Amp
　　原核表达
　　pTacI（BamHI）
　　Amp
　　原核表达
　　pTALLuc
　　4956bp
　　Amp
　　哺乳动物细胞表达
　　pTWIN1
　　7375bp
　　Amp
　　pTXB1
　　6706bp
　　Amp
　　pVAX1
　　2999bp
　　Kan