自噬干货分享系列之线粒体自噬的研究策略

　　上期我们介绍了自噬干货分享系列之内质网自噬的研究策略，那么本期将继续进行自噬干货分享，本期内容小编将主要从线粒体自噬分类、介导线粒体自噬的经典通路、线粒体自噬的诱导与抑制来进行介绍。
　　什么是线粒体自噬？
　　在ROS、营养缺乏、细胞衰老等外界刺激的作用下，细胞内的线粒体发生去极化出现损伤，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成溶酶体的降解，这个过程称为线粒体自噬。线粒体自噬是细胞在应对氧化应激等压力条件下的生物学现象，用于清除多余的或者功能失调的线粒体，以维持线粒体数目和质量的平衡，对于整个线粒体网络的功能完整性和细胞生存来说十分关键。
　　线粒体自噬分类
　　基础线粒体自噬：细胞持续清理衰老和损伤的线粒体，确保线粒体能循环利用。线粒体自噬水平较高的器官包括：心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌和神经系统等；
　　应激诱导型线粒体自噬：细胞外应激信号会影响线粒体的生理功能，并且会引起线粒体膜电位消耗，导致急性线粒体清除；
　　程序性线粒体自噬：程序性线粒体自噬会在不同细胞的发育过程中被激活，包括视网膜神经节细胞发育，体细胞向多能干细胞的化学重编程过程，心肌细胞的成熟，红细胞分化，受精后精子来源的线粒体清除等过程。
　　图1。线粒体自噬的分类〔1〕
　　介导线粒体自噬的经典通路
　　1、PINK1Parkin信号通路。
　　在健康的线粒体中，PTEN诱导激酶1（PINK1）通过线粒体靶向序列靶向线粒体，并通过TOMTIM复合体进入到线粒体内膜，随后PINK1被线粒体内膜中的蛋白酶PARL切割，并最终被蛋白酶体降解。
　　当线粒体受损时，线粒体膜电位下降，PINK1无法进入线粒体内膜并在线粒体外膜积累，激活并招募Parkin，Parkin介导线粒体底物泛素化，泛素化后，包括p62在内的受体蛋白在线粒体外膜积累，导致泛素化产物通过与LC3结合被招募到自噬体中，成熟的自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，包含的线粒体随后被降解。
　　图2。PINK1Parkin介导的线粒体自噬〔1〕
　　2、BNIP3NIX信号通路。
　　BNIP3和NIX均位于线粒体的外膜，在缺血、缺氧的条件下，BNIP3可通过以下2种途径诱导细胞内线粒体自噬的发生：
　　BNIP3能通过其BH3结构域调控自噬的核心蛋白Beclin1竞争性地与Bcl2结合，进而诱导Beclin1的大量释放，激活线粒体自噬的发生；
　　BNIP3的N端具有LIR序列，其可识别LC3，并与之直接结合，从而诱导线粒体自噬的发生。
　　图3。受体介导的自噬〔1〕
　　3、FUNDC1信号通路。
　　FUNDC1是调控线粒体自噬的关键受体。
　　在正常条件下，FUNDC1被酪氨酸激酶磷酸化，此时与LC3的亲和力降低在缺血缺氧条件下酪氨酸激酶被灭活，FUNDC1与LC3的亲和力显著提升，并且FUNDC1可以被丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶通过去磷酸化的形式激活，进而诱导线粒体自噬的发生。
　　线粒体自噬的诱导与抑制
　　线粒体自噬与药物诱导的组织损伤神经退行性疾病癌症的发生发展密切相关因此有关线粒体自噬的问题越来越受到学者们的关注，在线粒体自噬的研究中，一般通过人为干预的方式来诱导或抑制线粒体自噬，方法主要包括药物处理、物理损伤、饥饿、线粒体自噬基因的敲降或过表达等
　　常用的线粒体的解偶联剂CCCP和FCCP作为诱导剂，引发线粒体短时间内剧烈的去极化和线粒体自噬的发生，但造成细胞骨架的破坏及溶酶体酸化的抑制，因此，实验中如抗霉素A等比较温和的诱导药物。此外，饥饿和光照辐射也可以诱导部分线粒体发生自噬。
　　环孢菌素A是一种抑制线粒体通透性改变的药物，作为线粒体自噬诱导后的保护剂，可明显降低线粒体自噬体的总量，此外，非免疫抑制剂NIM811也可发挥同样作用。
　　线粒体自噬相关基因的敲低或过表达可用于某一特定基因在整个线粒体自噬通路中的功能研究，如在果蝇PINK1Parkin依赖性线粒体自噬途径的研究中发现，敲除PINK1和Parkin可造成线粒体自噬的抑制。
　　线粒体自噬研究工具
　　线粒体自噬受到了越来越广泛的关注，那么我们如何直观地研究线粒体自噬呢？汉恒生物提供的线粒体自噬病毒研究工具，便于感染目的细胞后直观地观察线粒体自噬的变化。EGFPLC3单标记的荧光探针可以监测LC3蛋白参与自噬起始过程，Mitodsred线粒体特异性定位荧光探针可定位线粒体，两者共转染细胞即可准确实时地追踪线粒体自噬的动态过程。另外，mtKeima探针可独立应用于线粒体自噬的研究，Keima是一种H敏感的荧光蛋白，发射峰为620nm，在中性和酸性环境中分别于440nm和550nm处被激发，因此，随着时间的推移，递送到溶酶体的keima量可以通过在550nm处激发的信号强度和在440nm处激发的信号强度的比值来估计。鉴于发生自噬的线粒体最终会进入酸性的溶酶体中，所以将特异性定位于线粒体（mitochondrial）基质的靶向序列与keima融合形成mtkeima，可指示通过自噬途径进入溶酶体中的线粒体。另外，我们还有Cox8a基因融合绿光和红光（Cox8aEGFPmcherry）来研究线粒体自噬的病毒。
　　汉恒生物还有多种线粒体自噬通路单标研究工具ParkinEGFP、Bnip3EGFP、NixEGFP、FUNDC1EGFP，与Mitodsred线粒体共感染目的细胞，confocal检测共定位情况，可鉴别相关信号分子的线粒体转位。
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　　本期线粒体自噬研究介绍就到此结束了，相信看到这里的小伙伴一定有所收获，对于线粒体自噬也更加了然于心。下期我们将介绍分子伴侣介导的自噬，我们下期再见！
　　参考文献：
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