一种以测定成孔蛋白膜通透性的基于荧光淬灭的脂质体渗漏测定方法

　　该篇实验方法已经在JournalofBiologyChemistry文章NAcetylationofthevirulencefactorEsxAisrequiredformycobacterialcytosolictranslocationandvirulence中验证过。原作者将该方法的详细版本发表在Bioprotocol期刊，欢迎大家进入Bioprotocol期刊直接与作者交流。
　　简介
　　在这篇Bioprotocol文章中，来自德克萨斯大学的研究人员详细描述了测定成孔蛋白膜通透性的最佳脂质体制备方案，即以通过荧光去淬灭测量脂质体的泄漏。
　　亮点
　　1。在本方法中，作者通过在脂质体中加入荧光染料增效剂，即8氨基萘1，3，6三磺酸（ANTS）和对二甲苯双吡啶鎓溴化物（DPX），实现膜通透活性（MPA）测量的有效方法。
　　2。在本方法中，作者已成功地测量了结核分枝杆菌（Mtb）毒力因子的膜通透活性（MPA）。且相比与离子测定法，ANTSDPX去猝灭测定法具有更高的灵敏度、更准确一致以及更低的成本。
　　背景介绍
　　成孔毒素（PFT）是由微生物病原体产生的用于入侵宿主的毒力因子家族。PFT的主要作用是在脂质膜上形成孔，导致膜裂解和或其他效应使蛋白易位进入宿主细胞完成入侵。PFT经常与脂质膜相互作用，而脂质体在大小、脂质组成和装载货物等方面具有很大的适应性，因此常被当作测试PFT活性的可靠膜模型。使用脂质体测量孔形成或膜渗漏的常用方法是将离子封装在脂质体中，脂质体破裂后，释放的离子会发出可测量的信号，但是离子释放测定方法需要大量的离子探针和频繁更换的探针膜，而荧光染料则提供了一种新的测量途径。
　　步骤节选
　　stepA。Dryingphospholipids
　　stepB。PreparingcolumnandFPLCfordesalting
　　stepC。PreparingthelipidANTSDPXsolution
　　stepD。Producingliposomesviaextrusion
　　1。Assembletheextruderaccordingtothemanufacturer’sspecifications。
　　2。Drawup1mlofgelfiltrationbufferusingoneofthesyringesandpassthebufferthroughtheextruderuntiltheliquidhasbeentransferredtotheothersyringe。
　　3。Removethebufferfromthesyringe。
　　4。Drawupto1mlofliposomesintooneofthesyringes。
　　5。Passtheliposomesthroughthemembraneuntiltheliquidhasbeentransferredfromonesyringetotheother。
　　6。RepeatStepD5foratotalof20times。
　　7。Inspectthefluidafterextrusion；itshouldhavechangedfromanopaquetoatransparent，yellowtingedliquid（Figure1）。
　　8。Dispensethelipidsintoacleanglasstube。
　　stepE。Removalofexcessfluorescentdyesviadesaltingchromatography
　　Figure2。Mostlipidswilleluteafterflowingapproximately2mlofbufferthroughthecolumn。
　　stepF。Liposomeleakageassay
　　Figure3。RawplotsofanANTSDPXassay。
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　　原文链接：https：s。bioprotocol。org？sb0f0613c57f180f7
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　　Bioprotocol简介
　　Bioprotocol于2011年在斯坦福大学创建，致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。Bioprotocol期刊是Bioprotocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，Bioprotocol已发表了来自全球上万名优秀科研工作者（包括多名诺贝尔奖获得者）的4000多篇实验方案，并且同Science、eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年Bioprotocol期刊已被PubMedCentral，ESCI收录。