热文蛋白质检测方法蛋白质浓度测定常用的三种方法

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　　蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）
　　UV法
　　这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
　　（1）简易经验公式蛋白质浓度（mgml）〔1。45OD2800。74OD260〕Dilutionfactor
　　（2）精确计算通过计算OD280OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：
　　蛋白质浓度（mgml）F（1d）OD280D
　　其中d为测定OD值比色杯的厚度
　　D为溶液的稀释倍数
　　BCA法
　　原理BCA（bicinchoninincacid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2还原为Cu，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
　　BCA蛋白浓度测定试剂盒，Abbkine的蛋白质定量试剂盒（BCA法）提供一个简单，快捷，兼容去污剂的方法，准确定量总蛋白。
　　成分试剂A100mL试剂B2mL标准蛋白（BSA）1mL2，1mgmL
　　保存条件运输温度：室温（标准蛋白4～8运输）
　　保存温度：室温（标准蛋白20保存）
　　有效日期：12个月
　　使用方法
　　方法一：96孔板
　　1。配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液。充分混匀。
　　2。将蛋白标准品按0L，1L，2L，4L，6L，8L，10L加入96孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到10L。取10L待测样品加入96孔板的待测样品孔中。每个测定要做2～3个平行。
　　3。向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入200LBCA工作液（即样品与工作液的体积比为1：20），混匀。
　　4。37温浴30min。冷却至室温。
　　5。酶标仪562nm波长下测定吸光度。
　　6。制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。
　　蛋白质浓度测定常用的三种方法（详解）
　　方法二：试管法
　　1。配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做2～3个平行。本处列举的比色体系所用的是0。5mL的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。
　　2。BSA标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3个平行测定。标准曲线一般56个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释BSA时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为200gmL，可按下表的次序加入BSA标准品、样品及BCA工作液。
　　3。取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液1：20的比例混匀。37温浴30min。冷却至室温。
　　4。将样品与标准品在562nm波长下测定吸光度。
　　蛋白质浓度测定常用的三种方法（详解）
　　考马斯亮蓝法
　　实验原理考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。
　　考马斯亮蓝G250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
　　突出优点（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
　　（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和需要严格地控制时间。
　　（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K、Na、Mg2离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
　　缺点（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
　　（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
　　试剂与器材1、试剂考马斯亮蓝试剂：
　　考马斯亮蓝G250100mg溶于50mL95乙醇中，加入100mL85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
　　2、标准和待测蛋白质溶液（1）标准蛋白质溶液
　　结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0。15molLNaCl配制成1mgmL蛋白溶液。
　　（2）待测蛋白质溶液。人血清，使用前用0。15molLNaCl稀释200倍。
　　3、器材试管1。515cm（6），试管架，移液管管0。5mL（2）；1mL（2）；5mL（1）；恒温水浴；分光光度计。
　　操作方法一、制作标准曲线取7支试管，按下表平行操作。
　　摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色。
　　绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
　　二、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mgmL）。
　　注意事项（1）在试剂加入后的520min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
　　（2）测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
　　（3）利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
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