原代T细胞难转染？那是工具没选对

　　T细胞（Tcell、T淋巴细胞Tlymphocyte）是淋巴细胞的一种，在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。随着细胞免疫治疗的日益深入，T细胞的基因工程化改造显得越来越重要。
　　然而，T细胞的基因操作却异常困难，普通的DNA质粒根本就转不进去，即使是病毒介导的基因转染操作，也有不少难题，主要体现在几个方面：
　　1常规的慢病毒，由于
　　T细胞膜上受体的不稳定；
　　非激活的T细胞本身无增殖能力；
　　T细胞内部有阻碍反转录的机制等原因而导致慢病毒的T细胞感染能力偏弱，需要多次重复感染，且对于实验操作的条件要求十分苛刻
　　2体外培养的T细胞本身十分敏感且脆弱，慢病毒感染对细胞的状态影响非常大
　　3T细胞是悬浮细胞，进一步增大了病毒感染的难度
　　遇上这样磨人的细胞怎么办？
　　汉恒病毒载体工程师们深切体会到了大家的痛苦
　　通过多次实验，研发出适用于原代T细胞基因操作的悬浮细胞专用的腺病毒（Ads）和慢病毒（hTLv）。其中Ads也非常适用感染其他悬浮细胞，如Jurkat，K562，HL60和L1210等。慢病毒hTLv适用人原代T细胞的感染还可以用来构建稳转系。
　　感染效果图
　　汉恒原代T细胞感染实例使用悬浮细胞专用腺病毒ads感染
　　悬浮细胞专用腺病毒Ads感染小鼠原代CD4T细胞
　　细胞：小鼠原代CD4T细胞
　　刺激方式：CD3CD28抗体和IL2激活48h
　　病毒：AdsGFP，11010PFUml
　　使用方式：MOI500
　　悬浮细胞专用腺病毒Ads感染人原代CD4T细胞
　　细胞：人原代CD4T细胞
　　刺激方式：CD3CD28抗体和IL2激活48h
　　病毒：AdsGFP，11010PFUml
　　使用方式：MOI100
　　汉恒原代T细胞感染实例使用慢病毒
　　原代T细胞专用病毒慢病毒感染人原代CD4T细胞
　　细胞：人原代CD4T细胞
　　刺激方式：CD3CD28抗体和IL2激活48h
　　病毒：hTLvGFP，1108TUml
　　使用方式：MOI50
　　上文我们了解到T细胞是很难被感染的，除了使用正确的病毒工具外，在细胞制备后想要成功感染T细胞还有两个关键步骤：细胞体外刺激、细胞感染
　　细胞体外刺激
　　1。按照小鼠或人源CD4T细胞分离kit（Thermo）说明书分离得到CD4T细胞。
　　2。取所需体积的PBS，按照5gml的终浓度加入AntimouseCD3e和AntimouseCD28抗体，500l孔包被NonTreated24wellplate，室温放置4h，吸掉抗体悬液，加入500l1BSA（PBS配置）室温封闭30min，封闭结束加入500lPBS洗孔一次。
　　注：请在分离细胞的同时准备好平板，包括后续感染所需的量。
　　3将分离得到的CD4T按照浓度5x105cellml重悬在完全T细胞培养基中（1640，10FBS，1penicillinstreptomycin，50Mmercaptoethanol，100UmlIL2），将细胞加入步骤2中包被处理好的平板，2ml每孔（1x106cellwell），然后放入37CO2培养箱刺激培养48h。细胞在刺激24h后体积略微增大，进入活化状态，刺激48h后可进行病毒感染。
　　细胞感染
　　1。收集活化好的CD4T细胞，400g离心5min。用T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
　　2。另取一AntimouseCD3e和AntimouseCD28抗体包被好的24孔板，每孔加入25x105的细胞（若为96孔板，加入2x104细胞孔）。若考虑长期表达目的基因，按MOI50100加入汉恒生物T细胞专用慢病毒hTLvGFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的慢病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按MOI5001000加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒AdsGFP。同时加入polybrene至终浓度6gml，最终感染体积为500l，加入病毒后轻轻吹打混匀。
　　注：具体MOI选择可在96孔板中预实验进行梯度摸索，对于慢病毒建议使用10，30，100的梯度进行，对于腺病毒建议使用500，1000，1500的梯度进行摸索。
　　3。24wellplate于1000g室温离心感染90min。离心结束后将平板放入37CO2培养箱感染6h。
　　注：离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。
　　4。感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中350l的培养基（70），加入1。85ml的T细胞完全培养基补足体积为2ml并吹打混匀。
　　5。可选步骤：病毒感染24h后，小心吸掉培养基，在同一培养皿中按照24步进行病毒复感染操作。
　　6。将细胞放入37CO2培养箱继续培养，23天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，汉恒生物提供的T细胞专用慢病毒（hTLv）和悬浮细胞专用腺病毒（Ads）感染原代T细胞的效率大于50。